Construction of Plant Transient Expression Analysis Vector Matching With Yeast Single Hybrid System

Zhang Yuan　Huang Fang　Ma Yanlin　Ma Jianzhong*

College of life science and engineering, Lanzhou University of technology, Gansu 730050

*Corresponding author, majz@lut.cn

Abstract　In order to verify the plant transcription factors and their key domains resolved by yeast single hybrid system in plant cells/protoplasts, a set of plant transient expression analysis system matched with yeast single hybrid system was constructed, and transient expression analysis was carried out in Arabidopsis leaf protoplasts. The results showed that the reporter gene GUS could be activated in Arabidopsis protoplasts by the effector vector constructed from the transcriptional activation region (CRII) of AtDPBF4. This result is consistent with the result of CRII of AtDPBF4 in yeast cells. In the report vector, six heterozygous promoters containing UAS_Gal1 could induce the GUS transcription of the downstream report gene with an enzyme activity of 0.96 nmol 4-MU·mg^-1·min^-1; three heterozygous promoters containing UAS_Gal1 could induce GUS gene with an activity of 0.73 nmol 4-MU·mg^-1·min^-1. The heterozygous promoter with 6 UAS_Gal1 was stronger than that with 3 UAS_Gal1, but its activity was not twice as high as that of 3 UAS_Gal1, only 31.5% higher than that of 3 UAS_Gal1. This indicates that increasing the repeat sequence of the GAL4 binding site (UAS_Gal1) in the reporter gene can increase the expression of the downstream reporter gene, but this increase in activity does not have a linear relationship with the number of repeats of UAS_Gal1.

Keywords　Yeast single hybrid system, Plant transient expression analysis system; Vector construction

酵母单杂交系统(Yeast one-hybrid system, Y1H)不仅可用于发现新的转录因子，也可用于转录因子的结构解析(Fields and Song, 1989; Kim et al., 1997)。以Y1H发现的许多转录因子并不都是来源于酵母菌的，其中很多是从植物或动物来源的。通常，来自非酵母菌的转录因子需要在其来源物种细胞中进一步验证。为了验证酵母单杂交系统发现的植物转录因子，本研究构建了一组与Y1H载体(pGBKT7)相匹配的、可在植物细胞或原生质体中进行瞬时表达分析的载体系统(图1)。这套载体系统由4个载体组成：效应载体pHQEff-6、报告载体pHQRep(3x)和pHQRep(6x)、以及作为负对照的载体pHQEff-1。

效应载体pHQEff-6 (NCBI No. KJ184338.1)含有35S启动子、酵母转录因子GAL4的DNA结合区(Ma et al, 1988)、拟南芥亮氨酸拉链类转录因子AtDPBF4的转录激活区CRII (马建忠等, 2019, 中国专利，ZL 2015 1 0376978.2)、以及NOS终止子。对照载体pHQEff-1 (NCBI No.KM985459)除不含有转录激活区CRII外，其余与效应载体相同。报告载体pHQRep(3x) (NCBI No.KJ184340.1)和pHQRep(6x) (NCBI No. KJ184341.1)含有mini35S启动子、GAL4的DNA结合区识别元件UAS (upstream activating sequence)，报告基因GUS、以及NOS终止子。

在本研究构建的系统中，由于报告载体用到了GAL4识别的UAS序列，不仅避免了报告基因被植物内源的转录因子启动转录，而且效应载体中待验证的转录因子可直接从Y1H载体上亚克隆过来。除此之外，本研究所构建的2个报告载体pHQRep(3x) 和pHQRep(6x)所含有的UAS拷贝数不同，在pHQRep(3x)载体中含有3个UAS、而在pHQRep(6x)中含有6个UAS。之所以这样构建，目的之一在于对报告基因的表达强度可依研究工作的需要加以选择，另一目的也是想要了解UAS数目加倍是否会使报告基因的表达强度加倍。从研究结果表明，UAS数目的加倍可使报告基因的表达明显增强，但并不存在活性增加二倍的数量关系。

1结果与分析

1.1植物瞬时表达分析载体的构建

以pUC19质粒为起始载体，在其多克隆位点分别插入4个重组片段，获得了用于植物瞬时表达分析的4个重组载体：1个对照载体pHQEff-1 (NCBI No.KM985459)、1个效应载体pHQEff-6 (NCBI No.KJ184338.1)、以及两个报告载体pHQRep(3x) (NCBI No.KJ184340.1)和pHQRep(6x) (NCBI No.KJ184341.1) (图1; 图2)。

1.2拟南芥叶片原生质体中基因GUS瞬时表达分析

报告基因GUS由于其内源活性低、动态范围广，在植物瞬时表达系统中应用最为广泛。然而，随着培养时间的延长，GUS酶的活性稳步增加，GUS酶在拟南芥原生质体中存在内源活性(图3)。

我们对转化处理后培养了12 h的拟南芥叶肉原生质体进行了GUS酶活力的荧光分析。所测样品酶反应时间与4-MU浓度关系曲线图和ATDPBF4 的转录激活区CRII转录激活活性分析显示(图3)， 4-MU浓度关系曲线图和实验组和对照组的总蛋白含量对CRII转录激活活性中，实验组1：pHQEff-6+pHQRep(3×)的GUS 酶活性为0.73 nmol 4-MU·mg^-1·min^-1；实验组2：pHQEff-6+pHQRep(6×)的GUS 酶活性为0.96 nmol 4-MU·mg^-1·min^-1；对照组1：pHQEff-1+pHQRep(3×) 的GUS 酶活性为 0.47 nmol 4-MU·mg^-1·min^-1；对照组2：pHQEff-1+pHQRep(6×) 的GUS 酶活性为 0.52 nmol 4-MU·mg^-1·min^-1；以及不加任何载体处理的拟南芥叶肉原生质体阴性对照，其酶活性为 0.45 nmol 4-MU·mg^-1·min^-1。从以上结果可以看出，实验组 GUS酶活性显著高于对照，表明 AtDPBF4的CRII在植物细胞中也具有转录激活活性。同时，本实验还得出含有6个重复的GAL4结合位点 UAS _Gal1的报告基因载体与含有AtDPBF4 CRII的效应载体组合比含有3个重复UAS_Gal1的报告基因载体与含有AtDPBF4 CRII的效应载体组合具有较高的GUS酶活性，但是这种活性升高趋势并不与UAS_Gal1的重复数量呈线性关系。     

2讨论

在转录激活活性分析中，有几个来自于植物细胞的转录因子可以在酵母细胞中表现出激活转录的活性，例如王怀琴等(2016)利用酵母双杂交系统筛选出了丹参R2R3-MYB类植物转录因子SmPAP1相互作用的蛋白，而韩聚东等(2016)通过构建出的含有梭梭NAC植物转录因子家族基因的pGBKT7融合表达载体，并将其转入到AH109酵母菌当中进行了转录激活功能的分析，但是并不是每一个转录因子都可以在酵母和植物细胞中具有转录激活活性。例如，全长酵母转录因子GAL4，在GAL4结合位点的介导下却不可以在马铃薯细胞中激活报告基因的转录(Ma et al., 1988)。与之相反的是，来自于小麦HALF-1转录因子的转录激活域在马铃薯BY2细胞中具有转录激活活性，但却在酵母细胞中不能激活下游报告基因的表达(Okanami et al., 1996)。本实验以瞬时表达分析方法为手段，构建了一套与酵母单杂交系统相匹配的植物瞬时表达分析系统，来确定AtDPBF4的CRII是否能在植物细胞中激活报告基因的转录。实验数据显示，AtDPBF4的CRII在植物细胞中具有转录激活活性这一结果与先前在酵母中利用酵母单杂交得到的结果是完全一致的(马建忠等, 2019, 中国专利, ZL 2015 1 0376978.2)。另外，该实验中含有6个重复的GAL4结合位点UAS_Gal1的报告基因载体与含有AtDPBF4的CRII的效应载体组合相对于含有3个重复UAS_Gal1的报告基因载体与含有AtDPBF4的CRII的效应载体组合GUS活性增加了31.5%。正如我们所期待的，在报告基因中增加Gal4结合位点(UAS_Gal1)的重复序列可以提高下游报告基因的表达，但是这种活性升高趋势并不与UAS_Gal1的重复数量呈线性关系。本实验AtDPBF4的CRII在拟南芥叶肉原生质体中转录激活活性的验证中，不仅为转录因子 AtDPBF4 的转录激活和调控机理的研究奠定了基础，而且为瞬时表达载体、报告基因载体的构建过程中GAL4结合位点UAS _Gal1的重复序列的选择提供了参考信息。

3材料与方法

3.1实验材料

大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)、酿酒酵母AH109、哥伦比亚生态型(Columbia-0)拟南芥(Arabidopsis thaliana)、起始质粒pUC19、遗传元件提供质粒pCAMBIA1301、pGBKT7和pUC19-AtDPBF4均为马建忠研究员实验室保存。

3.2植物瞬时表达分析载体的构建

以pCAMBIA1301为模板，3个引物(表1)进行连接PCR扩增出启动子和终止子片段CaMV35S-NosTer，EcoRⅠ和HindⅢ酶切后连接至同样限制性内切酶消化后的pUC19质粒，获得重组质粒pUC19-CaMV35S-NosTer。35S启动子和NosTer终止子之间引入了新的限制性内切酶位点XbaⅠ和BamH Ⅰ。同时，将载体pGBKT7和重组载体pGBKT7-CRII分别经XbaⅠ和BamHⅠ酶切后获得Gal4DBD和Gal4DBD-CRII片段，然后在XbaⅠ和BamHⅠ位点与pUC19-35Spro-Noster连接，得到对照载体pHQEff-1。另外，在XbaⅠ和BamHⅠ位点之间插入一个扩增片段Gal4DBD-CRII，制备的重组质粒命名为pHQEff-6，作为效应载体。保守区Ⅱ是一个22个氨基酸片段，来自一种碱性亮氨酸拉链转录因子AtDPBF4，它在酵母和植物中都起转录激活作用。

用一对来自pCAMBIA1301的引物(表2)扩增Mini35S-GUS-NosTer片段，该引物引入了XbaⅠ和 Hind Ⅲ两个限制性酶切位点。将扩增片段在XbaⅠ和HindⅢ位点之间亚克隆到pUC19中，制备重组质粒pHQMini35S-GUS-NosTer。

3.3构建报告基因

GAL1与GAL4结合的UAS经化学合成后，在Gal4BS-F和Gal4BS-R两个寡聚DNA片段中重复三次(表3)。两个片段粘性末端进行退火处理后，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切消化，然后插入mini-35S启动子前 (表3)。所得到的质粒被命名为报告载体pHQRep(3×) (图1)。将未经消化的退火片段克隆到pHQRep(3x)的XbaⅠ位点，制成报告载体pHQRep(6×) (图1)。

3.4拟南芥原生质体制备、转化及报告酶GUS活性的测定

本实验从3~4周龄拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗中采集莲座叶进行原生质体制备、纯化(Yoo et al., 2007)，并使用荧光分光光度计(F97Pro13007, 上海棱光技术有限公司)进行GUS活性测定(Sahoo et al., 2014; Gong et al., 2007)。所有质粒使用UNIQ-500柱式质粒DNA大量抽提试剂盒(Sangon Biotech, China)进行提取。实验设计了5组共转化载体组合用以进行拟南芥原生质体中GUS基因瞬时表达分析，实验组包括pHQEff-6+pHQRep(3x)组合以及pHQEff-6+pHQRep(6x)组合。对照组包括pHQEff-1+pHQRep(3x)组合及pHQEff-1+pHQRep(6x)组合，以及不加任何载体的阴性对照组。每种质粒各取15 μg用于拟南芥原生质体的转化(Yoo et al., 2007)。在37℃恒温水浴培养后，测定其蛋白质含量和GUS活性(Bradford et al., 1976; Jefferson et al., 1987)。所有实验组和对照组均设置三个平行，并且每组实验重复三次，所有数据用SPSS20.0软件工具进行统计分析。

作者贡献

张媛、黄芳、马燕林是本研究的实验设计和实验研究的执行人；张媛、马燕林完成数据分析，论文初稿的写作；张媛、马燕林参与实验设计，试验结果分析；马建忠是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由受国家自然科学基金项目(编号31560073和31860063)的资助。

参考文献

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